暨南大學(xué)水生生物研究中心、廣東省高校水體富營(yíng)養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省微生物研究所、廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省華南應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

       摘 要:【目的】植物精油萃取自天然植物, 因具有抗菌活性, 近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。論文的目的是分析植物精油的化學(xué)成分, 測(cè)試其抗菌活性, 并研究其化學(xué)成分與抗菌活性之間的聯(lián)系。【方法】實(shí)驗(yàn)選取了肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油等 6 種典型植物精油, 通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用分析方法研究了其化學(xué)組分, 并通過(guò)污染食物技術(shù)研究了其對(duì)黑曲霉和繩狀青霉的抗真菌活性, 以及對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗細(xì)菌活性?！窘Y(jié)果】氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果表明, 肉桂、山蒼子、香茅和迷迭香等 4 種植物精油的化學(xué)成分主要是醛類和醇類, 丁香精油的主要化學(xué)成分是丁香油酚, 大蒜精油化學(xué)成分基本上都是含硫的醚類, 其中二烯丙基三硫醚(大蒜素)含量高?？咕钚越Y(jié)果顯示, 不同植物精油的抗菌活性不同, 6 種植物精油的抗真菌活性由強(qiáng)到弱依次為: 肉桂>大蒜>丁香>山蒼子=香茅>迷迭香, 抗細(xì)菌活性由強(qiáng)到弱依次為: 肉桂>山蒼子>丁香>香茅=迷迭香>大蒜。【結(jié)論】植物精油的抗真菌、細(xì)菌活性與其化學(xué)組分密切相關(guān), 肉桂、山蒼子、香茅和迷迭香等 4 種精油的抗菌活性可能主要與其化學(xué)成分中的醛類和醇類有關(guān), 丁香精油較高的抗菌活性可能主要源于丁香油酚; 大蒜精油具有高效的抗真菌活性主要源于其化學(xué)成分中的含硫醚。不同植物精油化學(xué)成分不同, 抗真菌、細(xì)菌活性也不同, 表明其可能有不同的抗真菌與抗細(xì)菌機(jī)制。

       近年來(lái), 環(huán)保法規(guī)日益嚴(yán)格, 人類更加注重健康, 崇尚自然。在這種形勢(shì)下, 研發(fā)一些新型的天然、低毒的抗菌劑成了國(guó)內(nèi)外抗菌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。植物精油, 因其萃取自天然植物, 同時(shí)又具有廣譜的抗菌活性, 日益受到國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注, 植物精油抗菌活性及其機(jī)制的研究也成了一個(gè)比較活躍的研究領(lǐng)域。

 植物精油又稱揮發(fā)油或香精油, 是萃取植物特有的芳香味兒油狀液體, 取自于草本植物的花、苞、葉、枝、根、樹(shù)皮、果實(shí)、種子和樹(shù)脂等, 以蒸餾和壓榨等方式提煉出來(lái)[1?3]。研究報(bào)道稱, 植物精油具有廣譜的抗微生物活性, 能夠抑殺細(xì)菌、真菌和病毒[4?10]。而且, 植物精油能夠影響微生物各個(gè)階段的生長(zhǎng): 生長(zhǎng)延滯期延長(zhǎng), 指數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率下降, 總的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量降低[2]。除此之外, 一些研究表明, 植物精油能夠抑制真菌毒素的產(chǎn)生, 如 Sindhu等[11]報(bào)道了姜黃(Curcuma longa L.)葉油能夠抑制黃曲霉的生長(zhǎng), 并抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生, Rassoli 和 Owlia[12]報(bào)道了百里香屬(Thymus)的T. eriocalyx 和 T. X-porlock 兩種精油也能夠抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生。本文選擇了香茅(Cymbopogon citrates)精油、山蒼子(Litsea cubeba)精油、肉桂(Cinnamomum zeylanicum)精油、丁香(Syzygium aromaticum)精油、迷迭香(Rosmarinus officinalis)精油和大蒜(Allium sativum)精油等 6 種典型植物精油, 通過(guò) GC-MS 分析了它們的化學(xué)成分, 研究了它們對(duì)革蘭氏陰性的大腸桿菌(Escherichia coli)和革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗細(xì)菌活性, 以及對(duì)黑曲霉(Aspergillus niger)和繩狀青霉(Penicillium funiculosum)這兩種典型的常見(jiàn)污染霉菌的抗真菌活性, 并探討了植物精油化學(xué)成分與抗菌活性之間的聯(lián)系。本研究選取了幾種典型的植物精油, 對(duì)其化學(xué)組分、抗細(xì)菌和抗真菌活性, 以及化學(xué)組分與抗菌活性之間的聯(lián)系開(kāi)展了較為系統(tǒng)的研究工作, 該研究將為獲得具有高效抗菌活性的植物精油, 開(kāi)發(fā)新型的植物精油抗菌劑提供重要的研究基礎(chǔ)。

 1 材料與方法 

 1.1 菌株、培養(yǎng)基和精油 

香茅精油、山蒼子精油、肉桂精油、丁香精油、迷迭香精油和大蒜精油為純天然植物精油。

大腸桿菌 ATCC 8739, 金黃色葡萄球菌ATCC 6538 均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心, 由本實(shí)驗(yàn)室保存; 黑曲霉 GIM 3.412, 繩狀青霉 GIM 3.103 均購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心, 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

MH (Mueller hinton)培養(yǎng)基、PDA (Potato dextrose agar)培養(yǎng)基均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用 MH 瓊脂修飾培養(yǎng)基是在 MH 培養(yǎng)基中加入 0.5%的 Tween 20 和 1.5%的瓊脂后高溫滅菌配制, PDA 修飾培養(yǎng)基是在PDA 培養(yǎng)基中加入 0.5%的 Tween 20 后經(jīng)高溫滅菌配制。

 1.2 實(shí)驗(yàn)方法 

   1.2.1 霉菌孢子懸液和細(xì)菌懸液的配制[13?15]:將黑曲霉和繩狀青霉分別接種到 PDA 斜面培養(yǎng)基中, 置于恒溫培養(yǎng)箱中 28 °C 培養(yǎng) 7 d。將培養(yǎng)好的黑曲霉和繩狀青霉斜面分別用滅菌的0.1%的 Tween 80 洗脫孢子, 將孢子懸液充分渦旋混勻, 并用 0.1%的 Tween 80 分別稀釋至5×106CFU/mL (血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))備用。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別從 MHA 斜面上接種到 MH培養(yǎng)基中, 置于搖床上 35 °C振蕩培養(yǎng)2?4 h 至指數(shù)生長(zhǎng)期, 分別取指數(shù)生長(zhǎng)期的菌液1 mL, 離心棄上清, PBS 各洗滌 1 次, 并用 PBS重懸, 分別稀釋至 5×106CFU/mL (測(cè) OD600 調(diào)節(jié)菌濃度)備用。

1.2.2 植物精油的氣質(zhì)聯(lián)用分析[16?19]: 6 種植物精油通過(guò)美國(guó) Thermo Finnigan 公司的 Trace GC/DSQ 氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析, 所用色譜柱為 DB-5ms (長(zhǎng) 30 m×直徑 0.25 mm×填充粒子直徑 0.25 μm)。色譜條件為: 初始溫度為 60 °C, 保持 2 min, 之后以 10 °C/min 的速度升溫至220 °C, 保 持 15 min, 載 氣 He, 流 速 1.0 mL/min。程序升溫進(jìn)樣模式(PTV)分流進(jìn)樣, 分流比為 1:50。進(jìn)樣口溫度從初始 70 °C 升溫至 250 °C。電離方式為 EI, 離子源溫度為 200 °C, 四級(jí)桿掃描范圍 30?450 m/z, 傳輸線溫度 250 °C。將樣品的質(zhì)譜圖與 NIST 質(zhì)譜庫(kù)中的標(biāo)樣進(jìn)行比對(duì) , 對(duì)化合物進(jìn)行試驗(yàn)性的分析鑒定。

1.2.3 植物精油的抗真菌活性研究(污染食物技術(shù), Poisoned food technique)[15,17]: 將 PDA修飾培養(yǎng)基熔化后, 將香茅、山蒼子、肉桂、丁香、迷迭香和大蒜精油等 6 種植物精油分別加入到 PDA 修飾培養(yǎng)基中, 使每種植物精油均配制成如下濃度梯度(V/V): 0, 0.016%, 0.031%, 0.063%, 0.125%, 0.250%, 0.5%, 1%。取黑曲霉和繩狀青霉的孢子懸液(5×106CFU/mL)各 100 μL, 分別加到平皿上(即每個(gè)平皿約 5×105CFU), 涂布均勻, 每種精油每個(gè)濃度每種霉菌各做 3 個(gè)平行, 帕拉膠膜將平皿邊緣封口, 置于恒溫培養(yǎng)箱中 28 °C 靜置培養(yǎng)28 d, 觀察統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 植物精油的抗細(xì)菌活性研究(污染食物技術(shù))[15,17]: 將 MH 瓊脂修飾培養(yǎng)基熔化后, 將香茅、山蒼子、肉桂、丁香、迷迭香和大蒜精油等 6 種植物精油分別加入到 MH 瓊脂修飾培養(yǎng)基中, 使每種植物精油均配制成如下濃度梯度(V/V): 0、0.016%、0.031%、0.063%、0.125%、0.25%、0.5%、1%。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液(5×106CFU/mL)充分混勻后, 各取 100 μL, 分別加到平皿上(即每個(gè)平皿約5×105CFU), 涂布均勻, 每種精油每個(gè)濃度每種菌各做 3 個(gè)平行, 置于恒溫培養(yǎng)箱中 35 °C 培養(yǎng) 7 d, 觀察統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 2 結(jié)果與分析 

2.1  6 種植物精油的氣質(zhì)聯(lián)用化學(xué)組分分析

根據(jù)氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果, 6 種植物精油的可能化學(xué)組分見(jiàn)表 1。由表 1 可以看出, 肉桂精油的醛類總含量約為 87%, 醇類總含量約 8%; 山蒼子精油醛類總含量約 71%, 醇類總含量約 4%; 香茅精油的醇類總含量約 40%, 醛類總含量約38%; 迷迭香精油醇類總含量約 54%, 醛類總含量不足 1%; 丁香精油的主要化學(xué)組分是丁香油酚, 約占了總化學(xué)組分的 85%。大蒜精油的化學(xué)組分比較特殊, 基本上都是含硫的醚類, 其中二烯丙基三硫醚(大蒜素)含量高, 約占總的化學(xué)組分的 30%。

2.2   6 種植物精油的抗真菌活性

6 種植物精油對(duì)黑曲霉和繩狀青霉的最低抑制濃度(Minimum lnhibitory concentration, MIC)見(jiàn)表 2, 從表 2 可以看出, 肉桂精油的抗真菌活性強(qiáng), 其次是大蒜精油、山蒼子精油、丁香精油和香茅精油, 迷迭香精油的抗真菌活性弱。肉桂精油對(duì)黑曲霉的實(shí)驗(yàn)組處理 1 d時(shí), 黑曲霉對(duì)照即長(zhǎng)滿白色菌絲, 黑曲霉的0.016%?1%處理組均沒(méi)有霉菌生長(zhǎng)跡象; 處理2 d 時(shí) , 對(duì)照組已開(kāi)始長(zhǎng)了黑色孢子 , 0.016%?0.031%處理組已經(jīng)長(zhǎng)了白色菌絲, 但未長(zhǎng)孢子, 0.063%?1%處理組沒(méi)有霉菌生長(zhǎng)跡象; 處理 7 d 時(shí), 對(duì)照組平皿已長(zhǎng)滿黑色孢子, 0.016%?0.031%精油處理組也都長(zhǎng)了黑色孢子, 0.063%?1%均沒(méi)有黑曲霉生長(zhǎng); 直到處理 28 d,

0.063%?1%精油處理組仍沒(méi)有黑曲霉生長(zhǎng), 因此肉桂精油對(duì)黑曲霉的低抑制濃度處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)均為 0.063%。肉桂精油對(duì)繩狀青霉的實(shí)驗(yàn)處理 1 d 時(shí), 對(duì)照組即長(zhǎng)滿白色菌絲, 0.016%?1%處理組均沒(méi)有繩狀青霉生長(zhǎng)跡象; 處 理 2 d 時(shí) , 對(duì)照組開(kāi)始長(zhǎng)了青色孢子 , 0.016%?0.031% 處理組長(zhǎng)了白色菌絲 , 0.063%?1%處理組沒(méi)有繩狀青霉生長(zhǎng); 處理 7 d時(shí), 對(duì)照組長(zhǎng)滿青色孢子, 0.016%?0.031%處理組也長(zhǎng)了青色孢子, 0.063%?1%處理組沒(méi)有繩狀青霉生長(zhǎng); 直到處理 28 d 時(shí), 0.063%?1%處理組均沒(méi)有霉菌生長(zhǎng), 因此, 肉桂精油對(duì)繩狀青霉的低抑制濃度處理 7 d 和處理 28 d 亦均為 0.063%。

從表 2 可以看出, 大蒜精油對(duì)黑曲霉的低抑制濃度在處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)分別為0.063%和 0.125%, 大蒜精油對(duì)繩狀青霉的低抑制濃度在處理 7 d 和 28 d 時(shí)亦分別為 0.063%和 0.125%; 丁香精油對(duì)黑曲霉和繩狀青霉的低抑制濃度在處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)均為0.125%; 山蒼子精油對(duì)黑曲霉的低抑制濃度在處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)分別為 0.125%和0.25%, 山蒼子精油對(duì)繩狀青霉的低抑菌濃度在處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)亦分為 0.125%和0.25%; 香茅精油對(duì)黑曲霉的低抑制濃度在處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)分別為 0.125%和 0.25%, 香茅精油對(duì)繩狀青霉的低抑制濃度在處理 7 d 和處理 28 d 時(shí)亦分別為 0.125%和0.25%; 迷迭香精油對(duì)黑曲霉和繩狀青霉的低抑制濃度在處理 7 d 時(shí)均為 1%, 處理 28 d 時(shí) 0.016%?1%處理組均沒(méi)能完全抑制黑曲霉和繩狀青霉的生長(zhǎng)。

2.3 6 種植物精油的抗細(xì)菌活性

6 種植物精油對(duì)兩種細(xì)菌的低抑制濃度結(jié)果見(jiàn)表 3, 由表 3 可以看出, 肉桂精油的抗細(xì)菌活性強(qiáng), 其次是山蒼子精油和丁香精油, 香茅和迷迭香的抗細(xì)菌活性較弱, 而大蒜精油在 0.016%?1%的處理濃度下沒(méi)有顯示出抗細(xì)菌活性。6 種植物精油的實(shí)驗(yàn)中, 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的對(duì)照組在處理 1 d 時(shí), 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別布滿平皿。肉桂精油對(duì)大腸桿菌的低抑制濃度在處理 1 d 和處理 7 d時(shí)分別為 0.016%和 0.031%, 肉桂精油對(duì)金黃色葡萄球菌的低抑制濃度在處理 1 d 和處理 7 d時(shí)亦分別為 0.016%和 0.031%; 山蒼子精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的低抑制濃度在處理 1 d 和處理 7 d 時(shí)均為 0.125%; 丁香精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的低抑制濃度在處理 1 d 和處理 7 d 時(shí)均為 0.25%; 香茅精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的低抑制濃度在處理 1 d 和處理 7 d 時(shí)均為 1%; 迷迭香精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的低抑制濃度在處理 1 d 和處理 7 d 時(shí)均為 1%; 大蒜精油在0.016%?1%處理濃度下, 沒(méi)能抑制住大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

3 討論 

根據(jù)植物精油抗菌活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 6 種植物精油的抗真菌活性由強(qiáng)到弱依次為: 肉桂精油>大蒜精油>丁香精油>山蒼子精油=香茅精油>迷迭香精油, 抗細(xì)菌活性由強(qiáng)到弱依次為:肉桂精油>山蒼子精油>丁香精油>香茅精油=迷迭香精油>大蒜精油。由此可以看出, 肉桂精油的抗真菌和細(xì)菌活性強(qiáng), 山蒼子和丁香精油的抗真菌和細(xì)菌活性也很高, 大蒜和香茅兩種植物精油的抗真菌活性很強(qiáng), 但抗細(xì)菌活性較弱, 尤其大蒜精油在實(shí)驗(yàn)濃度下不能完全抑制細(xì)菌的生長(zhǎng); 迷迭香精油的抗真菌和細(xì)菌活性較弱。不同植物精油的抗真菌、細(xì)菌活性存在差異, 其抗真菌、細(xì)菌活性強(qiáng)弱與其化學(xué)組分密切相關(guān), 據(jù)報(bào)道, 植物精油組分抗微生物活性大小排序如下: 酚類(活性高)>肉桂醛>醇類>醛類=酮類>酯類>碳?xì)浠衔镱怺20–21]。本實(shí)驗(yàn)中, 肉桂、山蒼子、香茅、迷迭香精油都含有大量的醛類和醇類, 其高效的抗菌活性可能與醛和醇的抗菌活性相關(guān), 丁香精油的主要化學(xué)組分是丁香油酚, 其較高的抗真菌、細(xì)菌活性也可能主要源于丁香油酚, 此外, 這 5 種精油中的一些微量成分也可能對(duì)抗菌活性起到了增效的作用; 大蒜精油的主要化學(xué)組分為以大蒜素為主的含硫醚類, 大蒜精油具有高效的抗真菌活性, 但抗細(xì)菌活性較弱, 可能某種含硫醚起到了主要的抗真菌作用, 也可能是幾種含硫醚發(fā)揮了協(xié)同抗真菌作用。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可看出, 植物精油的抗真菌活性和抗細(xì)菌活性之間存在著明顯的差異, 大蒜精油的抗真菌活性和抗細(xì)菌活性差異很大, 抗真菌活性很高, 僅次于肉桂精油位列第二,而抗細(xì)菌活性卻差; 香茅精油的抗真菌活性和抗細(xì)菌活性差異也較大, 抗真菌活性較強(qiáng), 抗細(xì)菌活性較弱; 山蒼子精油和丁香精油的抗真菌活性也是略優(yōu)于其抗細(xì)菌活性; 肉桂精油的抗細(xì)菌活性略優(yōu)于其抗真菌活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 植物精油的抗真菌活性比抗細(xì)菌活性更強(qiáng),且革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌更敏感[2]。本實(shí)驗(yàn)中大蒜、香茅、山蒼子、丁香精油都是抗真菌活性優(yōu)于抗細(xì)菌活性, 只有肉桂精油例外, 但本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)肉桂、山蒼子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌活性有顯著差異。實(shí)驗(yàn)中, 金黃色葡萄球菌的精油處理組菌落數(shù)量有時(shí)會(huì)比大腸桿菌要少一些, 但是精油對(duì)兩種細(xì)菌的低抑制濃度沒(méi)有明顯差異, 因而從本實(shí)驗(yàn)不能得出革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)植物精油更敏感的結(jié)論。本文只發(fā)現(xiàn)了植物精油的抗真菌活性與抗細(xì)菌活性之間存在差異, 未發(fā)現(xiàn)對(duì)黑曲霉和繩狀青霉兩種不同真菌的抗菌活性之間的差異, 也未發(fā)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌兩種不同細(xì)菌的抗菌活性之間存在差異。由此, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植物精油很可能具有不同的抗真菌和抗細(xì)菌的機(jī)制, 有關(guān)植物精油的抗真菌和抗細(xì)菌機(jī)制有待進(jìn)一步的研究與分析。此外, 大蒜精油和香茅精油的抗真菌活性很高, 而抗細(xì)菌活性不明顯, 將會(huì)在細(xì)菌發(fā)酵領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值, 能夠抑制細(xì)菌發(fā)酵中的真菌污染等。