肝癌是發(fā)生于肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞的惡性腫瘤，具有發(fā)病年齡輕、惡性程度高、起病隱匿、進展快等特點。目前肝癌治療手段主要包括手術(shù)、化療和放療等，但手術(shù)切除不 徹底、復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高是影響肝癌臨床治療療效的主要問題，其治療的總體療效仍不理想。而天然抗腫瘤藥物因具有療效顯著、副作用小、作用獨特與研究成本低的特點逐漸廣泛應用于臨床治療。

連香樹（Cercidiphyllum japonicum）又名山白果、云義樹和五君樹，是連香樹科連香樹 屬的一種古老落葉高大喬木。主要分布于日本和我國山西南部、四川西部與東南部等海拔 400~2 500 m 的常綠和落葉闊葉混交林中。連香樹果實主要治療小兒的驚風抽搐肢冷等癥 狀；樹皮煎水后飲服，對感冒、痢疾等疾病具有特殊療效；其甲醇提取物能抑制蔬菜病原菌的活性。雖然連香樹擁有較高藥用價值，但缺乏對其功效的系統(tǒng)科學研究。目前對連香 樹的研究大多數(shù)是關(guān)于瀕危狀況、培育繁殖、群落結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和生態(tài)特性等方面，而 針對其次生代謝和功能開發(fā)方面研究較少。本實驗采用連香樹精油處理人肝癌 SMMC-7721 細胞，探究其對該細胞增殖、凋亡與自噬的影響，并檢測自噬與凋亡相關(guān)蛋白探究其可能的 抗腫瘤機制，進一步為肝細胞癌的治療提供依據(jù)，同時為連香樹的開發(fā)利用提供理論參考。

科研結(jié)果與分析

一、連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞增殖的影響

      連香樹精油對 SMMC-7721 細胞增殖的影響結(jié)果見圖 1，由圖 1 可知，精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。處理 12、24、48 h 后的 IC50 值分別為 0.108、0.104、0.132 mg/mL，可得出 24 h 處理后 IC50 值為最小，因此選取 24 h 作為后續(xù)試 驗的處理時間。

二、連香樹精油使人肝癌 SMMC-7721 細胞阻滯在 G2 /M 期

      連香樹精油對 SMMC-7721 細胞周期的影響如圖 2，G0/G1 期的細胞比例由 73.47%下降 到 66.27%；G2/M 期的細胞比例由 7.14%升高至 11.14%，說明此時部分細胞阻滯在 G2/M 期。

三、連香樹精油誘導人肝癌 SMMC-7721 細胞凋亡

3.1 連香樹精油對 SMMC-7721 細胞凋亡率的影響 

用流式細胞儀檢測連香樹精油誘導 SMMC-7721 細胞凋亡率的結(jié)果見圖 3，隨著連香樹 精油濃度的升高，細胞凋亡率呈劑量依賴性升高。當處理濃度為 0 mg/mL 時，細胞凋亡率 （早凋+晚凋）為 4.19%；當處理濃度為 0.6 mg/mL 時，細胞凋亡率（早凋+晚凋）為 20.58%。

 AO/EB 染色后 SMMC-7721 細胞凋亡形態(tài)結(jié)果見圖 4，由圖 4 可知，隨著連香樹精油濃 度的升高，綠色熒光的活細胞數(shù)目減少，呈桔紅色或紅色熒光的凋亡細胞數(shù)增多。

3.3 連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞線粒體膜電位的影響 

      經(jīng) JC-1 法測定連香樹精油處理人肝癌 SMMC-7721 細胞后胞內(nèi)線粒體膜電位的變化情 況結(jié)果見表 1，由表 1 可知，隨著連香樹精油濃度的升高，SMMC-7721 細胞內(nèi)的膜電位比 值呈劑量依賴性下降。表明連香樹精油誘導人肝癌 SMMC-7721 細胞線粒體膜電位下降。

3.4 連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞 Caspase1,8 的影響 

      連香樹精油對凋亡與焦亡相關(guān)蛋白的影響如表 2 所示，由表 2 可知，隨著連香樹精油濃 度的升高，SMMC-7721 細胞內(nèi) caspase8 相比對照組無明顯上調(diào)趨勢，Caspase1 相比對照組 先下降后上升但無明顯升高趨勢，表明連香樹精油沒有明顯通過誘導死亡受體介導的細胞凋 亡和活化 caspase1 介導的細胞焦亡兩條途徑來誘導細胞死亡。

四、連香樹精油誘導人肝癌 SMMC-7721 細胞自噬

4.1 透色電鏡觀察自噬體形態(tài) 

      透色電鏡下自噬體形態(tài)如圖 5 所示，由圖可知，當連香樹精油濃度為 0 mg/mL 時，細 胞結(jié)構(gòu)完整，核膜清晰；當連香樹精油濃度為 0.3 mg/mL 時，細胞內(nèi)染色質(zhì)呈無規(guī)律的塊狀 分布，出現(xiàn)許多明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)或者包裹著需要降解的細胞器的自噬體，說明連香樹精油 誘導人肝癌 SMMC-7721 細胞自噬。

4.2 連香樹精油對自噬相關(guān)蛋白的影響 

      連香樹精油對自噬相關(guān)蛋白的影響如圖 6 所示，結(jié)果表明，隨著連香樹精油濃度的升高， 細胞中自噬相關(guān)蛋白 LC3-Ⅰ逐漸向 LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，造成 LC3-Ⅱ蛋白的大量積累，Beclin-1 的 蛋白水平明顯上調(diào)，表明連香樹精油誘導了人肝癌 SMMC-7721 細胞發(fā)生較高水平的自噬。

五、連香樹精油誘導的自噬抑制人肝癌 SMMC-7721 細胞凋亡

      為研究連香樹精油誘導SMMC-7721細胞自噬在凋亡中的作用，將自噬抑制劑氯喹和連 香樹精油共同孵育SMMC-7721細胞，自噬相關(guān)蛋白表達結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，LC3-Ⅰ 蛋白積累較多，LC3-Ⅱ蛋白減少，表明自噬受到抑制。抑制連香樹精油誘導SMMC-7721細 胞的自噬后，蛋白表達結(jié)果如圖8所示，Bcl-2抗凋亡蛋白隨連香樹精油濃度的增大而明顯下 調(diào)，表明在抑制了連香樹精油誘導人肝癌SMMC-7721細胞的自噬后促進了連香樹精油對人 肝癌SMMC-7721細胞的凋亡作用。

結(jié)論很重要

近年來，植物來源的天然提取物及其次生代謝產(chǎn)物生物活性的研究備受關(guān)注[7]，特別是 植物抗腫瘤藥物領(lǐng)域發(fā)展迅猛。目前已篩選出具有抗腫瘤活性的植物提取物多達 3 萬種，應 用于臨床的抗腫瘤藥物已有 80 多種。具有生理或者藥理活性的植物提取物能夠通過阻滯 細胞周期，誘導細胞發(fā)生凋亡和自噬等方式來抑制并殺死腫瘤細胞。本研究也從這幾個方 面研究了連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞的作用情況。

細胞有絲分裂的正常運行對細胞的增殖和生長有著重要的調(diào)控作用，阻滯細胞周期導致 細胞周期紊亂已經(jīng)成為藥物作用于腫瘤細胞的新靶點。研究表明，蛇床子通過阻滯 N87 胃癌細胞 G2/M 期從而抑制細胞增殖；SHIP2 同樣阻滯喉癌 Hep-2 細胞的 G2/M 期。在 本研究中，連香樹精油處理人肝癌SMMC-7721細胞24 h后，細胞中G0/G1期的比例由73.47%下降到 66.27%，G2/M 期的比例由 7.14%升高至 11.14%，推測連香樹精油通過將部分人肝癌 SMMC-7721 細胞阻滯在 G2/M 期達到抑制細胞分裂的作用。

細胞凋亡是一個在相關(guān)基因調(diào)控下進行高度程序化的過程，遵循固有的程序性自殺機 制，細胞發(fā)生凋亡時可以形成凋亡小體，最后被鄰近的細胞或吞噬細胞所吞噬。在本實 驗中，連香樹精油處理人肝癌 SMMC-7721 細胞 24 h 后誘導了腫瘤細胞的凋亡，表現(xiàn)為線 粒體膜電位的下降。細胞外源死亡受體介導的凋亡主要的三條 Fas/FasL、TRAIL 和 TNFR 信號轉(zhuǎn)導通路都需要 caspase8 的活化。本研究中測定了連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細 胞中 caspase8 蛋白的影響，發(fā)現(xiàn) caspase8 蛋白水平相比對照組無顯著上調(diào)，推測連香樹精 油沒有通過外源死亡受體途徑誘導人肝癌 SMMC-7721 細胞凋亡。

細胞焦亡是近年來新的一種依賴于炎癥小體半胱天冬酶-1（caspase-1）的細胞死亡方式。Wei 等的研究表明半夏凝集素通過激活 MAPKs/NF-κb 通路釋放 IL-1β，IL-1β 依賴于 caspase1 發(fā)揮促炎作用。本研究中，通過測定連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞中 caspase1 蛋白的水平發(fā)現(xiàn) caspase1 與對照組相比先下調(diào)后上升，無明顯上調(diào)趨勢，推測連香 樹精油沒有誘導人肝癌 SMMC-7721 細胞焦亡。 

細胞自噬是細胞通過自噬溶酶體途徑從而降解細胞內(nèi)自身物質(zhì)的過程，與細胞凋亡都屬 于細胞程序性死亡。二者間存在緊密的聯(lián)系，主要表現(xiàn)為：一，自噬和凋亡共同促進細胞 死亡；第二，自噬與凋亡互為拮抗作用，自噬為腫瘤細胞提供生存所須的原料或 ATP，抑制 細胞凋亡；第三，自噬促進細胞向凋亡的轉(zhuǎn)化。Li 等的研究發(fā)現(xiàn)藥用植物遠志中的甌 黃酮誘導 SKOV3 和 OVCAR3 人卵巢癌細胞發(fā)生的自噬抑制了其誘導的凋亡作用；還有研 究表明饑餓誘導 K562/ADM 白血病細胞發(fā)生保護性自噬，抑制其凋亡的發(fā)生。本研究發(fā) 現(xiàn)連香樹精油誘導了人肝癌 SMMC-7721 細胞自噬，推測自噬過程抑制了腫瘤細胞的凋亡作用。在加入自噬抑制劑后，Bcl-2 抗凋亡蛋白水平顯著下調(diào)，促進了 SMMC-7721 細胞的凋亡作用，表明連香樹精油處理 SMMC-7721 細胞后誘導的自噬作為一種保護機制存在，二者表現(xiàn)為拮抗作用?？梢钥紤]通過抑制細胞的自噬過程來促進連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞的凋亡作用來殺死腫瘤細胞。 

綜上所述，連香樹精油對人肝癌 SMMC-7721 細胞具有顯著的細胞毒性作用，顯著降低 了細胞活力并破壞細胞結(jié)構(gòu)；通過阻滯部分 G2/M 期的細胞影響細胞周期；降低細胞中的線 粒體膜電位誘導 SMMC-7721 細胞發(fā)生凋亡。同時連香樹精油能夠強烈人肝癌 SMMC-7721 細胞發(fā)生自噬，而自噬在精油誘導的細胞凋亡中作為一種保護機制存在。

文章原作：四川師范大學生命科學學院

                    李飛，楊添雁，沙秀芬，李群